Пробоподготовка в гистологии и морфологии играет очень важную роль: от неё зависит точность микроскопических исследований. Для получения качественных препаратов применяется специальное (микротом, гистопроцессор, криостат и пр.) и общелабораторное (микроскоп, весы, водяная баня и др.) оборудование. В статье рассмотрим этапы гистологической пробоподготовки, требования к её проведению и применяемое оборудование.
Содержание:
- От чего зависит качество гистологической пробоподготовки
- Оборудование для морфологической лаборатории
- Основные этапы приготовления гистологических препаратов
- Заключение
От чего зависит качество гистологической пробоподготовки
Гистология применяется как в клинической (морфологической) диагностике, так и в фундаментальных исследованиях. Качество микроскопических исследований напрямую зависит от правильно организованной и проведенной пробоподготовки гистологических препаратов. В свою очередь, качество гистологических препаратов зависит от:
- Соблюдения технологии подготовки;
- Качества специального оборудования;
- Профессионализма и опыта лаборантов.
Получение информативных гистологических препаратов может осложняться артефактами, мешающими точной интерпретации результатов или делающими её невозможной. Поэтому особенную важность приобретает соблюдение очередности и правил пробоподготовки и применяемое для этого оборудование.
Оборудование для морфологической лаборатории
В состав морфологической лаборатории входят специальные помещения для различных этапов пробоподготовки (вырезки, проводки и др.), микроскопических исследований, при необходимости – работы с животными (виварии, операционные и т. д.), культурами клеток (асептические боксы).
Помещения обязательно должны оснащаться приточновытяжной вентиляцией. Необходимо учитывать тот факт, что при работе с гистологическими образцами приходится иметь дело с химическими и легковоспламеняющимися веществами: кислоты, спирты, летучие токсичные соединения, парафин и т. д. Поэтому нужно соблюдать строгие правила безопасности. Также осторожности требует работа с режущими инструментами (микротомные лезвия и проч.). Для защиты лаборанты должны использовать специальные средства индивидуальной защиты (перчатки, маски и т. д.).
Повышению эффективности и стандартизации процессов в морфологической лаборатории служит их автоматизация с помощью современного оборудования и программного обеспечения. Она позволяет упростить ведение документооборота и сам процесс пробоподготовки, сократить время на него и избежать ошибок из-за человеческого фактора.
Специальное оборудование для гистологии
Оборудование для морфологической (шире – гистологической) лаборатории делится на два типа: специальное и общего назначения. К специальному относятся приборы и аппараты, без которых процесс пробоподготовки невозможен: криостат, микротом, цитологический процессор и т. д. Также к специальному оборудованию относятся доски и столы для вырезки материала, применение которых позволяет получать образцы тканей определенной формы и толщины.
Для маркировки образцов применяют специальные принтеры (для предметных стекол и гистологических кассет). Автоматическая маркировка делает более точным обозначение материалов для хранения и использования, а устойчивые химические чернила позволяют избежать стирания надписей, упростить их чтение. Маркировка штрих-кодами подходит для применения со сканирующими микроскопами.
Гистологические процессоры позволяют автоматизировать процесс проводки образцов, уменьшить контакт лаборанта с реагентами. Производительность гистопроцессоров увеличивает число исследований, а значит и экономическую эффективность лаборатории.
К специальному оборудованию относятся заливочные станции, позволяющие проводить заливку гистологических образцов в парафин или другой фиксатор. Они могут быть как полностью, так и частично автомазированными.
Для изготовления срезов тканей применяются микротомы, которые делятся на санные и ротационные, автоматические и полуавтоматические. Для автоматической окраски гистологических срезов используют специальные приборы – стейнеры. Также автоматическое окрашивание и заключение гистологических срезов можно производить в едином аппаратном комплексе.
Для предотвращения загрязнения гистологических образцов все операции с ними проводят в ламинарном шкафу или боксе антибактериальной среды, которые также относятся к специальному гистологическому оборудованию.
Общелабораторное оборудование
К общелабораторному оборудованию относится, в первую очередь, микроскоп – оптический прибор для изучения гистологических образцов с увеличением.
В морфологических лабораториях используются различные типы микроскопов: световые, цифровые, люминесцентные и т. д. Они имеют разную разрешающую способность, увеличение и комплектацию, включая объективы (ахроматические или планахроматические), окуляры, конденсоры и т. д.
Микроскоп состоит из механической и оптической части:
- Механическая – штатив, тубус, револьверное устройство, предметный столик, механизмы коаксиальной фокусировки и перемещения предметного столика;
- Оптическая – объективы, окуляры, осветительная система.
Исследование гистологических препаратов, в зависимости от целей, возможно в светлом и темном поле, методом масляной иммерсии, люминесценции и т. д.
Для изучения объектов, помещенных в лабораторную посуду, применяются инвертированные микроскопы, в которых образец находится над объективом. Для сканирования гистологических препаратов и архивирования полученных данных применяют сканирующие микроскопы.
К лабораторному оборудованию общего назначения относятся также: pH-метр, весы, автоклав, криокамера, автоматические пипетки, шейкер, термостат, водяная баня, центрифуга, аквадистиллятор, вытяжной шкаф и проч.
Основные этапы приготовления гистологических препаратов
Основными этапами пробоподготовки в морфологической (гистологической) лаборатории являются:
- Взятие биологического материала;
- Промывка и фиксация материала;
- Проводка и заливка образцов;
- Создание парафиновых блоков;
- Приготовление срезов;
- Окраска и заключение.
Взятие биологического материала должно осуществляться острыми режущими инструментами во избежание его деформации. Необходимо учитывать особенности органа, из которого взят образец. При наличии патологического процесса нужно, чтобы в материале были и измененные, и неизмененные участки ткани.
Сразу после взятия образец должен быть промаркирован. Маркировка должна быть разборчивой и четкой. Она наносится влагостойкими чернилами. Избежать путаницы и потери гистологических образцов помогает система штрихкодирования (уникальный штрихкод образца наносится на этикетку емкости с фиксатором, гистологические кассеты и предметные стекла, для чего применяются специальные принтеры).
Образец взвешивается и промывается в физиологическом растворе от крови, желчи, слизи и т. п. Необходимо следить за тем, чтобы в ходе манипуляций не происходило пересушивание ткани, иначе она утратит свою ценность в качестве материала исследования. К артефактам образцов относятся также механическая деформация, размозжение и разрывы.
Следующий этап пробоподготовки гистологических образцов – фиксация их для сохранения прижизненной структуры клеток. Вырезанные, промытые образцы помещаются в емкости из прозрачного пластика или стекла с плотной широкой крышкой. Не допускается использование металлической лабораторной посуды.
Существует два основных метода фиксации гистологических образцов:
- Химический – помещение их в раствор фиксатора;
- Термический – нагревание биологических образцов.
Оба метода имеют свои достоинства и недостатки. Главное условие удачной фиксации образцов – соблюдение технологии. В качестве жидкости для химической фиксации применят парафин, целлоидин, желатин и т.п. или синтетические смолы.
Окончательное формирование гистологических образцов происходит после их фиксации, когда они становятся плотнее, а работа с ними проще. Формирование образца заключается в вырезке фрагмента нужной формы и размера, отсечении лишних участков и подравнивании краев. Вырезка образцов должна происходить на чистой поверхности и чистыми инструментами.
Проводка биологического материала – инкубация его в спиртах и органических растворителях для полного прекращения всех химических реакций в образце, что позволяет в дальнейшем делать достаточно тонкие срезы уплотненных образцов, оптимальных для микроскопии.
Проводка может производиться вручную или с применением гистологических процессоров, что значительно повышает скорость и качество работы и увеличивает производительность морфологической лаборатории. Качество проводки напрямую зависит от соблюдения технологии, рекомендаций производителя гистопроцессора и регулярной смены реагентов.
Для заливки гистологических образцов в парафин применяются заливочные станции – оборудование, имеющее подогреваемую рабочую поверхность, дозатор для парафина, охлаждающую поверхность. Станции заливки могут быть полностью автоматическими или полуавтоматическими. Их использование позволяет повысить эффективность работы лаборатории по сравнению с ручной заливкой образцов.
Окончательная заливка в парафин производится с помощью диспенсера, где парафин поддерживается нагретым до +56–58 °С. Диспенсер имеет нагревательную и охлаждающую платформу.
После извлечения гистологических кассет с образцами тканей, пропитанными парафином, из процессора, образцы ориентируются с помощью пинцета в нагретые формочки с горячим парафином; их накрывают и плотно прижимают гистологической кассетой, долив сверху парафин до краев кассеты, и помещают на охлаждающую плату или хладагент, где происходит застывание парафинового блока. Ориентирование образов в кассетах производится в соответствии с их особенностями и целями исследования.
Полученному парафиновому блоку придают форму усеченной пирамиды с основанием в форме прямоугольника или трапеции. Его основание подплавляют и прикрепляют на промаркированной колодке.
Современный прибор для вырезки гистологических образцов – микротом. Он состоит из следующих основных частей: корпус, держатель объекта, держатель микротомного ножа, подающий механизм.
Держатель объекта позволяет прочно зафиксировать колодку с блоком, а держатель ножа – лезвие микротомного ножа под нужным углом. Угол наклона ножа регулируется в зависимости от типа и характеристик объекта. Перемещение образца на нужное расстояние относительно микротомного ножа обеспечивает подающий механизм. В ротационных микротомах, в отличие от санных, объект смещается относительно неподвижного микротомного ножа. Подающий механизм позволяет микротому производить последовательные (серийные) срезы заданной толщины. Применение автоматических микротомов уменьшает роль человека, упрощая создание срезов и делая их точнее и тоньше. Однако даже в этом случае участие лаборанта необходимо.
Ультратом – прибор, с помощью которого можно производить срезы толщиной менее 1 мкм: полутонкие и ультратонкие – для трансмиссионного электронно-микроскопического исследования.
Получение замороженных срезов тканей возможно с помощью приборов, совмещающих в себе микротом и криостат – микротом-криостатов.
Окраска гистологических срезов позволяет лучше визуализировать структуру тканей и клеток. Окрашиваемость зависит как от структуры ткани, так и от свойств красителя. Парафиновые срезы не воспринимают красители, перед окрашиванием осуществляется их депарафинизация с помощью инкубации среза в течение 10–15 минут в жидкости, растворяющей парафин, например о-ксилоле, после чего срезы регидратируют, проводя через 2–3 смены этилового спирта, и помещают в дистиллированную воду. После этого срезы можно окрашивать. Распространенная методика окрашивания – гематоксилином и эозином. Также можно применять специфические методы: по Маллори, Массону, Ван Гизону, Перлсу и др.
Для длительного сохранения свойств гистологического среза его заключают под покровное стекло: на срез наносят монтирующую срезу и заключают под стекло таким образом, чтобы все пространство между предметным и покровным стеклом было заполнено монтирующей средой и не было пузырьков воздуха. Монтирующие среды для гистологических срезов должны быть прозрачными, с коэффициентом преломления близким к коэффициенту преломления стекла и не взаимодействовать с красителями (канадский бальзам и синтетические среды –полистирол, акриловые смолы и др.). Применение аппаратов для заключения препаратов под покровное стекло значительно повышает скорость и качество работы.
Заключенный под стекло окрашенный и промаркированный срез называется гистологическим препаратом. Гистологические препараты оставляют горизонтально до полного затвердевания монтирующей среды, после чего их можно использовать для микроскопических исследований.
Заключение
В гистологии и морфологии огромное значение имеет качество подготовки препаратов для исследования. Соблюдение технологии этапов пробоподготовки и применение качественных инструментов и современного оборудования, в том числе автоматизированного, позволяет добиться высокой ценности препаратов. Автоматизация этапов пробоподготовки помогает избежать ошибок идентификации образцов и повысить производительность морфологической лаборатории.
